小鼠ELISA试剂盒的双抗体夹心法

　　小鼠ELISA试剂盒的双抗体夹心法

　　以下是必赢线路检测3003对小鼠ELISA试剂盒双抗体夹心法的详细操作流程及关键要点，综合多来源实验方案整理：

　　一、实验原理

　　通过两种特异性抗体(包被抗体与酶标抗体)分别结合抗原的不同表位，形成"固相抗体-抗原-酶标抗体"复合物，最终通过酶催化底物显色定量抗原浓度‌。

　　二、操作步骤

　　包被抗体固定‌

　　用包被缓冲液稀释抗体至1-10μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜或室温孵育3小时‌。

　　甩尽孔内液体，用PBST洗涤3次(每次浸泡3分钟，拍干)‌。

　　封闭非特异性位点‌

　　加入200μL含5%脱脂奶粉的PBST封闭液，室温孵育1小时‌。

　　再次洗涤3次，去除未结合封闭蛋白‌。

　　加样与孵育‌

　　标准品‌：梯度稀释(通常S1-S7)后每孔加100μL，从低浓度到高浓度悬空加入‌。

　　样本‌：离心取上清，每孔加50-100μL，覆膜后37℃孵育90分钟‌。

　　酶标抗体反应‌

　　加入生物素化抗体工作液100μL/孔，37℃孵育60分钟，洗涤5次‌。

　　加入HRP标记链霉亲和素(按1:100稀释)，避光孵育20分钟‌。

　　显色与终止‌

　　每孔加TMB底物90μL，避光反应15-30分钟(显蓝色梯度)‌。

　　加入50μL终止液(2M硫酸)，蓝色立即转黄色，450nm测OD值‌。

　　三、关键注意事项

　　标准品处理‌

　　需离心(10,000g, 1min)后梯度稀释，涡旋混匀避免浓度误差‌。

　　洗涤控制‌

　　自动洗板机建议设置浸泡30秒程序，手动洗板需拍干并更换吸水纸区域‌。

　　加样技巧‌

　　使用多通道移液器垂直悬空加样，不同浓度/样本需更换吸头‌。

　　四、数据分析

　　以标准品浓度为横坐标(log值)、OD450为纵坐标绘制曲线，计算样本浓度‌。

　　若使用双波长校正，需从450nm值中减去630nm或570nm背景值‌。

　　注：以上资料仅供参考，完整操作请以实说明为准，不同品牌可能存在细节差异‌。

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